細菌分類的濫觴和演變

形態學時代

細菌是微生物學中的要角,有關其分類的探討可以從各種角度切入,但是最早期的細菌分類,純以形態特徵的區分為主。細菌分類經歷形態學、生理學及生化學、化學分類學、分子生物學等階段,目前已進展到一個嶄新的里程。

細菌不同于動植物,無法直接利用肉眼觀察其形態,因此研究方法有其獨特之處。研究細菌,首先須在無菌條件下操作,進行純化分離,藉此取得純菌株。除了無菌操作外,確立細菌純化分離方法的關鍵因素,包括培養皿的研製、利用洋菜配製培養基、滅菌釜的發明等。

1882年,赫斯(W. Hesse)發現從紅藻萃取出來的多醣類物質,也就是俗稱的洋菜,適合做為培養基固化劑。他把這項發現告知柯霍(R. Koch)以后,不只促成柯霍分離出結核菌,也帶動此后微生物學研究的迅速發展。1887年,貝特力(R. J. Petri)研發啟用培養皿,使得處理微生物不再是難事。

1884年,革蘭(C. Gram)發明了革蘭氏染色法,進行組織內細菌分染。1890年,羅福樂(F. L?ffler)研創細菌鞭毛染色法,藉此完成了一些細菌鞭毛著生狀態的報告。革蘭和羅福樂的報告顯示,19世紀晚期的攝影技術已經相當進步。細菌細胞的觀察辨認,也因顯微鏡的改良進步和染色法的開發應用而成為可能。類似上述觀察、培養和分離細菌的方法,也廣泛應用于研究其他的微生物。

德國植物學者柯恩(F. Cohn)原本從事植物生理,以及藻類和低等菌類的分類與形態研究,后來著手研究細菌。1872年,他把細菌分為球菌、短桿菌、長桿菌和螺旋菌4群,并且記載了微球菌、細菌、桿菌、弧菌、螺旋菌、螺旋體等6屬。當時,柯恩把細菌定義為:具有特定形態,不具葉綠體的細胞;利用分裂方式繁殖,以單細胞、絲狀細胞或集合體的方式生長。
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在細菌分類系統不明確的年代,柯恩根據自身觀察并詳查當時文獻后指出,細菌的屬種與動植物的屬種不同,是以形態異同為依歸的形態屬、形態種。他認為日后釐清細菌細胞的形態和其他形質的關係以后,細菌屬種的概念才可望明確。他也察覺一般細菌和藍細菌類似之處,這對后來原核生物和真核生物的分類有指引的作用。

柯恩把細菌分為4群,并非只是把相同形態的集合在一起而已,而是根據廣泛研究與比對后歸納出來的結論。他認為以形態為基礎整理出的屬種與細菌的代謝、色素生成、病原性等的關聯,須待日后更多的研究才能釐清。值得一提的是,柯恩是枯草桿菌的命名者,他指出這種桿菌可產生孢子,孢子萌發后成為活細胞。他證實枯草桿菌的孢子具耐熱性,這是支持巴斯德(L. Pasteur)所提倡非自然發生說的有利證據。

柯霍從死于炭疽病的動物分離出細菌,將其培養且接種至健康動物后,發現可使健康動物感染炭疽病,而且可從遭受感染的動物體內分離出原來接種的細菌。所謂柯霍準則(Koch's postulates),亦即驗證細菌是病因的一系列步驟,乃由此而來。柯霍氏法則主要分為四個步驟:

  1. 在病株罹病部位經常可以發現可能的病原體,但不能在健康個體中找到。
  2. 病原菌可被分離并在培養基中進行培養,并記錄各項特徵。
  3. 純粹培養的病原菌應該接種至與病株相同品種的健康植株,并產生與病株相同的病徵。
  4. 從接種的病株上以相同的分離方法應能再分離出病原,且其特徵與由原病株分離者應完全相同。

柯恩相當肯定柯霍的炭疽病研究,他除了協助柯霍把病原菌命名為炭疽桿菌外,還發現炭疽桿菌與枯草桿菌具類似的形態,都會產生孢子,但是兩者當中只有炭疽桿菌是病原菌。因為有上述種種研究成果,杜錄思(G. Drews)在1999年撰文推崇柯恩是現代微生物學的始祖。

生理學與生化學時代

細菌形態簡單,不易藉之區分不同菌種,因此早在19世紀晚期,生理和生化性質已開始被採用為細菌分類的指標。

1889年,貝杰林克(M. W. Beijerinck)以磷光素生成為基礎,設立發光細菌屬,這是最早把生化性質導入細菌分類的實例。他利用選擇培養基進行增菌培養,分離出定氮桿菌屬細菌,以及多種光合微生物和化合微生物。他也利用醣類發酵和硝酸還原進行當時名為產氣桿菌屬,如今已改名為腸內桿菌屬細菌的鑒定。1892年,維諾格拉斯基(S. Winogradsky)以自營能力為指標,設立了亞硝酸單胞菌屬及亞硝酸桿菌屬。

麥古拉(M. Migula)是柯恩的研究伙伴,他于1900年發表《細菌系統》一書,其中記載約1,300種細菌,并提及明膠液化。麥古拉在該書中依照細胞內含硫粒和光合色素,把細菌分為真細菌及硫細菌。

1909年,歐拉詹森(S. Orla-Jensen)調查細菌鞭毛著生位置和代謝,藉此把細菌分為頭端鞭毛類和周鞭毛類兩亞目。頭端鞭毛類包含球狀、桿狀和螺旋狀細菌,其中有運動能力的具有極鞭毛。周鞭毛類也包含球狀和桿狀細菌,但不含螺旋狀細菌,其中有運動能力的具有周鞭毛。

克魯維爾(A. J. Kluyver)是貝杰林克的接班人,他的研究主題是「微生物是什么樣的生物?」,并以一般的微生物學觀點,廣泛進行研究。 1924年,克魯維爾發表了〈微生物代謝的統整與分歧〉一文,他也曾根據酵母的醣類發酵特性,進行醣類區分及定量。1933年,他和帕坤(L. H. C. Perquin)共同發表了霉菌震蕩培養,其實驗所用的克魯維爾三角瓶是通氣培養器材的始祖。

1936年,克魯維爾和范尼爾(C. B. van Niel)根據細胞形態、運動性和營養方式,做了「細菌屬」的分類。這是一個類似元素周期表的組合,推測日后會發現的屬,則空欄以待。他們論及細菌演化,認為球菌是最簡單的細菌,由此演化出其他類別的細菌。這種觀點并不正確,但是他們標榜以一般微生物學觀點,嘗試把細菌分類與形態學和生化學結合一起的努力,仍然值得肯定。

1957年,英國學者史尼斯(P. H. A. Sneath)把18世紀亞當森(M. Adanson)提倡的生物分類原理具體化,倡導數值分類學。亞當森對當時主流觀點,即林奈(C. von Linn^重視特定形質的觀點,抱持懷疑的看法。他主張應把所有形質視為等價(同等重要)。不過,數值分類開始風行是電腦發達以后的事情了。

數值分類表示相似度,有納入或不納入負的相符二類算式,前者是單純相符,后者如杰卡德式。二類算式都有人使用,其計算方法各有多種。

曾經盛極一時的數值分類,不再風行的理由如下。一、史尼斯指出用于數值分類的形質,須是利用相同方法取得的數據資料。然而不少研究實例,都是蒐集自不同文獻,利用不同方法獲得的數據資料來計算。二、如依據抗生素感受性之類的特定形質進行計算,悖離數值分類原理。三、依照數值分類建構的樹狀圖,大多無法以其他方法驗證其妥適性。

例如曾經有人根據119種性狀資料建構短桿菌群的數值分類樹狀圖,發現與利用化學分類(DNA鹼基組成,DNA/DNA相關性等)為依據所得到的分析結果,二者完全不具任何相關性。經改為只取用其中57種研判適用于數值分類的形質,重行分析建構的樹狀圖,則與化學分類的分析結果具有高度相關性。

細菌分類今后勢必愈來愈倚重電腦,但這與電腦用于傳統的細菌數值分類,不能混為一談。正如光學顯微鏡的發達對細菌分類帶來巨大影響,電子顯微鏡的發明及超薄切片技術的開發,使得吾人得以觀察細菌細胞的基本構造。位相差顯微鏡、微分干涉顯微鏡、掃描式電子顯微鏡等的發明,也讓生物細胞變得更容易觀察,藉此可辨識原核和真核生物細胞的基本構造,并區分細菌和其他微生物的差別。

1957年,道夫提(E. C. Dougherty)經由鏡檢察覺,細菌細胞核比其他生物細胞核簡單,因而提議把細菌的細胞核稱為原核,其他生物的細胞核則稱為真核。

1962年,史丹尼(R. Y. Stanier)和范尼爾共同發表的〈細菌概念〉,可說是有關微生物多樣性研究的集大成論文。該文指出細菌細胞是原核細胞,具有如下特徵:一、不具區隔細胞核和細胞質的細胞核膜;二、不具含有光合作用或呼吸作用相關酵素的機械構造;三、細胞核分裂屬于無絲分裂而非有絲分裂。史丹尼和范尼爾兩人以細胞構造相同性,印證了柯恩所推測細菌和藍細菌的近緣關係。

化學分類學時代

化學分類著重于研究DNA、RNA、蛋白質等物質,以及其他維持生命所需細胞成分,藉此探討微生物的分類、鑒定和演化。最早的化學分類學研究,是藉由色素和精油的化學構造探討植物的類緣關係。1962年,馬莫(J. Marmur)和杜提(P. Doty)把DNA鹼基組成導入細菌分類學的研究。后來DNA/DNA相關性、脂肪酸組成、磷脂質組成、酉昆型、酵素蛋白質電泳圖譜等,也陸續被採用為細菌分類的依據。

以下事例反映了化學分類學的發展:一、以探討DNA、RNA、蛋白質和其他細胞成分為基礎的生化、分生和遺傳的發展進步,開啟了建立微生物的系統和相互關係的門路;二、儀器的開發進步,使得眾多樣品所含微量成分的分析得以在短時間內完成;三、電腦功能不斷強化,因而得以利用數理統計處理眾多數據;四、微生物保存方法的研發充實,使得原本不易保存的微生物,不再難以保存;五、菌株保存機構的增加和國際化,使得標準株和參考株不再難以取得。

早期學者常有想把自己分離的菌株與其他已發表的菌株作比較,卻苦于無從取得的情形。也有根據記載資料比較,認為明顯不同,俟取得菌株實際檢核比對后,卻發現并無兩樣。因此,菌株收集的充實對細菌分類學的研究有相當大的助益。

化學分類最重要成果之一,在于根據DNA/DNA 相關性定義的「細菌種」概念,廣為細菌分類學者支持。1987年,原名「國際系統細菌學委員會(International Committee on Systematic Bacteriology,簡稱ICSB)」的「國際原核生物分類系統委員會」(International Committee on Systematics of Prokaryotes,簡稱ICSP)轄下某一特別部會,對于「細菌種」發表過類似見解:一種細菌的親緣定義,在于所含菌株彼此間具70%或更高的DNA/DNA相關性,同時也具有攝氏5度或更低的ΔTm 值。

把含有DNA的薄鹽溶液緩慢加熱至一定溫度以上時,該溶液在紫外光波長區的吸光值會開始不斷增大,繼續升溫至一定溫度后,吸光值就達恆定不再改變。吸光值增大是因DNA雙股螺旋構造受熱融解,變成單股DNA之故。吸光值增大的溫度區間之點溫度稱為DNA的熱變性溫度或融點Tm ,ΔTm意指兩菌株間的Tm差距。惟ICSP并未正式認可這一見解。

根據這一見解,不少以前被鑒定為同種的細菌株,陸續被指出其實并非同種。顯然,早期菌種中心收集的保存株,難免包含一些鑒定錯誤的。因此,種內菌株關係研究不夠充分的菌種,今后有必要以DNA/DNA相關性為依據進行檢討。

分子分類學時代

1965年,查克勘得(E. Zuckerkandl)和保淩(L. Pauling)在其合著〈演化歷史的分子紀錄〉一文中,提出「資訊大分子」是生物演化的分子時鐘概念,由此開啟了分子分類學的序幕。資訊大分子是指負載遺傳訊息,或其轉譯訊息的大分子化合物,包括DNA、RNA和蛋白質。他們認為最合理、最普遍的演化系統,應完全根據資訊大分子提供的訊息來重建。

1968年,日本學者木村(M. Kimura)以群聚遺傳學為依據,發表了「分子演化的中立理論」,藉由導入核酸置換率(Knuc),標示生物演化距離。這一學說使得沒有化石紀錄的微生物演化,成為可以探討論述的課題。

1987年,伍斯(C. R .Woese)的研究團隊利用16S rRNA目錄法,進行細菌演化系統的研究,由此建構出微生物的分子系統學。更早之前的1979年,堀(H. Hori)和小澤(S. Osawa)兩位日本學者,根據5S rRNA序列重建生物系統樹(包括細菌和人在內的形形色色生物),他們認為伍斯所指古細菌比真細菌出現晚,而且比真細菌接近真核生物,因此稱為后生細菌。

這一見解后來受到伍斯的認同,因此古細菌被改稱為古生物。伍斯研究團隊原本使用SAB (不同菌株16S rRNA序列相似度)表示演化距離,后來改用木村所用的Knuc。

微生物系統關係透過上述先驅性研究,愈來愈清楚。分子分類學發展給生物分類學帶來的最大影響,在于確認以往被認為處于生物最高階層的動物界、植物界和細菌三者之間,動植物比較相近,兩者都與細菌相距甚遠,因而有比「界」更高階的「域」的提議。原被稱為古細菌的原核生物,在演化路徑上其實與真細菌迥異,因此改稱古生物,自成一域。有關細菌系統的研究,已經有很多相關報告。其中普羅提歐門細菌約略等同于革蘭氏陰性細菌,包括α、β、γ、δ和ε五群。

1968年在東京舉行的第1屆世界微生物株保存會議中,柯威兒(R. R. Colwell)以海洋弧菌為例,提倡多元分類,也就是多方探討,把可能取得的實驗數據全部用于分類學研究。目前多元分類或多元探討,已經成為微生物分類學的廣泛用語。

其實早在1970年代,已經出現不少利用多元手法探討細菌分類的相關文獻,只是當時尚未使用多元分類之類的語彙而已。例如1972年,山形(K. Yamagata) 和駒形(K. Komagata)兩位日本學者曾根據細胞分裂模式、DNA鹼基組成、細胞壁組成等研究數據,探討了棒狀桿菌中被歸類于不同屬群菌株的相互關係。

細菌分類學要素

柯宛(S. T. Cowan)是英國著名的細菌分類學者,他在1965年撰文指出,細菌分類包括分類(製作細菌分類體系,把各個細菌分類群擺置于能反映系統的階層)、鑒定(辨認分離株特徵,對照分類體系,決定分離株的分類位置)和命名(對分類群加以命名)3項要素。這3項要素其實有如雞尾酒般混合在一起,不易明確區分。1993年,駒形綜觀細菌學發展,進一步提出細菌分類學除了分類、命名和鑒定外,應再加上系統(細菌的系統演化)的見解。

細菌學研究初期,分類體系尚未建立,細菌命名不具統整性。隨著研究逐漸進展,系統研究和鑒定實務兩條路線開始出現觀念落差。細菌分類基本上具有哲學和實務兩個面相,前者是分類和系統的研究,后者則是鑒定實務,兩者似有矛盾,其實是構成細菌分類的共同要素。細菌分類的健全茁壯,有賴分類、命名、鑒定和系統4個構成要素的均衡發展。

伯吉氏系統細菌學手冊

《伯吉氏系統細菌學手冊》(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology,簡稱BMSB)是從事細菌分類鑒定不可或缺的檢索書,惟不少微生物學者并未充分了解這本書的性質,因此特別把它的由來簡單說明如下。

1915年,美國細菌學家學會(已改名為美國微生物學會)總會為了做成科或屬層次的細菌分類綱要,通過成立以溫斯露(C. E. A. Winslow)為委員長的細菌特性分析及分類委員會。因為1900年以來,出現了溫斯露、周普(W. Zopf)、麥古拉、古陸斯(W. Kruse)、詹森(C. O. Jensen)等人建立的多套細菌分類系統,不知其中哪一套最適用。該會綜合檢討后,在1917年先發表了細菌分類建議綱要,繼而于1920年提出只及于科或屬層次分類的最終報告。

美國細菌學家學會為了進一步出版可以檢索至種的檢索書,于是成立了以伯吉(D. H. Bergey)為委員長的委員會。經過廣泛文獻調查,《伯吉氏鑒定細菌學手冊》(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology,簡稱BMDB)初版在1923年問世,其中包含13科94屬。后來2至8版陸續于1925、1930、1934、1939、1948、1957、1974等年度出版,因會計問題,4版以后改由伯吉氏手冊信託(Bergey's Manual Trust)發行。

有鑒于細菌分類的蓬勃發展,伯吉氏手冊信託大幅更新內容,于1984年出版《伯吉氏系統細菌學手冊》第一卷。接著1986年出版第二卷,1989年出版第三、四卷。

第一卷收錄了在基礎、醫學、工業等範疇占有重要地位的革蘭氏陰性細菌。第二卷收錄放線菌以外的革蘭氏陽性細菌。第三卷包含藍細菌和其他光合細菌、第一卷未收錄的革蘭氏陰性細菌、以及當時稱為古細菌如今已正名為古生物的微生物。第四卷收錄放線菌。1994年,伯吉氏信託繼續出版以檢索為主的BMDB第九版,其中包含一些后來增加的新屬。

BMSB第二版的第一、二卷已陸續于2001年與2005年出版,第一卷收錄古生物(甲烷生成者、高度好熱者、高度好鹽者等)、藍細菌等光合細菌,以及一些具特異性、大多棲息于極端環境中的細菌。第二卷收錄包含絕大多數種類革蘭氏陰性細菌的普羅提歐門細菌。

第二版BMSB內含許多細菌分類學相關用語,極具參考價值。因尚未全部出版,無法窺得全貌,惟知其與第一版不同處,在于以16S rRNA基因序列比對為基礎建構系統,做成分類層級,并把原核生物分為古生物域和細菌域,兩域分別包含2門和23門。

BMSB廣為細菌分類學者和實務者使用,加上其執筆者有許多是ICSP所轄不同專門委員會的委員,因此這本書當然有它的權威性。然而必須認清的是,BMSB并非公定書,因其發行者是伯吉手冊信託,而非ICSP。ICSP是國際上細菌分類、命名的公定機構,《國際系統演化微生物學期刊》(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,簡稱IJSEM;原名International Journal of Systematic Bacteriology,簡稱IJSB)是這機構發行的唯一期刊,有關細菌分類和命名,悉以IJSEM所載為準。

今后的細菌分類學

細菌分類學逐步發展,目前已走到包含形態、生理、生化、細胞、生態、遺傳、分子生物等多元範疇分類的時代,這種發展態勢今后應不致改變。

最近隨機增幅多型DNA(randomly amplified polymorphic DNA,簡稱RAPD)與增幅片段長度多型性(amplified fragment length polymorphism,簡稱AFLP)分析法,以及其他基因體資訊解析法,被用于細菌分型、分類和演化的研究,也有報告論及這些方法所含問題。

以細菌分類學立場來看,這類方法的適用性,除了理論根據之外,尚須透過很多數據資料加以比對驗證。這些方法適合于什么目的?適用于哪些分類層級?是否只適用于特定類別細菌?這些問題有待逐一加以探討。隨著微生物多樣性的研究日趨發展,新種微生物不斷被分離發表,今后微生物所含新機能勢必不斷地被發掘出來,微生物生態學研究也勢必持續展現新的風貌。

微生物分離株的保存相當重要,以前有多少具研究價值的微生物曾經被分離出來,已經難以估算,但是可以確定的是,目前收集于世界各國菌株保存中心的菌株,仍不算多,加上生物多樣性條約生效,微生物株轉移變得困難。因此,有必要透過互信互惠的國際合作研究,增加微生物株的流通性。

自然界中究竟有多少能培養的微生物,近年來蔚為話題。有一說法認為,尚未培養出來的微生物,占全部微生物的95%,甚或是99%以上。存活但未能培養的微生物,也成為討論的話題。對于經核酸鹼基序列確認,但還沒分離的細菌,ICSP允許先將其設立為相當于屬層級的候選者,然而規定一旦這類細菌被分離時,命名優先權屬于分離人,而非核酸鹼基序列發表人。如何把候選者分離,帶入實驗室研究,是今后細菌學的一個課題。至于如何把候選者和已知細菌的分類體系做有效的整合,則又是另一個課題。

細菌分類研究的起步晚于其他生物分類研究,但是經由柯恩及其后諸多微生物學者的接棒努力,細菌分類學研究進展顯著。雖然柯恩的名氣不如巴斯德與柯霍兩位同時代的微生物學者,但是他能在130年前,就已對細菌有相當程度的理解,并且預知了當前的發展,實在不簡單。

細菌分類研究經過一個多世紀的發展演變,看似斷斷續續,其中自始不變的是,確認細菌為生物,并且能敏銳地掌握牠們的各項特質。細菌和其他各類微生物,自有人類以來就直接或間接地影響了人類的生存。因此,人類在善加利用微生物之余,千萬不要忘了微生物也是生物,也需要妥為保育。

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